慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 31-37.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.005

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慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达

黄爱华¹，周逸丹¹，张萍萍¹，王赛英¹，林媛媛¹，葛婷爱^1，陈赞²

1杭州市第三人民医院，浙江省杭州市 310000
2首都医科大学宣武医院神经外科，北京市 100053

收稿日期:2012-09-23 修回日期:2012-11-19 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 陈赞，副主任医师，首都医科大学宣武医院神经外科，北京市 100053 chenzan66@163.com
作者简介:黄爱华★，女，1982年生，浙江省杭州市人，汉族，2010年哈尔滨医科大学毕业，硕士，主要从事间充质干细胞的研究。 huang123_2002@163.com
基金资助:
国家高科技研究发展计划863项目(2006AA02A114)；北京市科委科技计划资助(D07050701350703)；北京市科技新星计划(2007B068)。

Expression of lentiviral vectors mediated NEP1-40 in mesenchymal stem cells fromhuman umbilical cord blood

Huang Ai-hua¹, Zhou Yi-dan¹, Zhang Ping-ping¹, Wang Sai-ying¹, Lin Yuan-yuan¹, Ge Ting-ai¹, Chen Zan²

1 Third People’s Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310000, Zhejiang Province, China
2 Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, China

Received:2012-09-23 Revised:2012-11-19 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Chen Zan, Associate chief physician, Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, Chinachenzan66@163.com
About author:Huang Ai-hua★, Master, Third People’s Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310000, Zhejiang Province, Chinahuang123_2002@163.com
Supported by:
863 Program of the National High-Tech Research and Development Program, No. 2006AA02A114*; a Grant from Beijing Committee of Science and Technology, No. D07050701350703*; Beijing Municipal Science and Technology New Star Program, No. 2007B068*

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来研究证明间充质干细胞具有高度增殖和多向分化潜能，是一种理想的组织工程种子细胞，能高效转染表达外源性目的基因，在基因治疗领域具有广阔的应用前景。
目的：将含有NEP1-40基因的慢病毒载体转染脐血间充质干细胞，评价基因转染后脐血间充质干细胞生物学功能变化，观察NEP1-40在脐血间充质干细胞中的表达。
方法：体外分离和培养人脐血间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标记，并对其生物学特性进行鉴定。同时将NEP1-40基因克隆入慢病毒载体，包装出病毒上清，以不同拷贝数转染脐血间充质干细胞。
结果与结论：实验通过密度梯度离心法成功在体外分离和培养脐血间充质干细胞，诱导其向脂肪细胞分化，流式细胞仪检测结果显示脐血间充质干细胞中CD90、CD73及CD105蛋白阳性，不表达CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白；real-time PCR检测发现其NEP1-40 mRNA表达水平与转染拷贝数有关，转染拷贝数越高，NEP1-40的表达量越高，此外转染NEP1-40后的脐血间充质干细胞中可检测到NEP1-40蛋白，提示NEP1-40基因转染后脐血间充质干细胞原有的生物学功能无明显影响。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血, 间充质干细胞, 慢病毒载体, 转染, NEP1-40, 863项目, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, studies have shown that mesenchymal stem cells are ideal seed cells used fortissue engineering because of their strong proliferation and multi-differentiation potential. Mesenchymal stem cells can be efficiently transfected and expressed exogenous gene, and therefore they have broad application prospects in gene therapy.
OBJECTIVE: NEP1-40 gene-containing lentiviral vectors were transfected into umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells to evaluate the biological function changes of mesenchymal stem cells and detect NEP1-40 expression in umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. Cell surface markers were detected by flow cytometry, and their biological characteristics were identified. NEP1-40 gene was cloned into the lentiviral vector and lentiviral supernatant was packaged. Then umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were transfected with different multiplicities of infection.
RESULTS AND CONCLUSIONS: We successfully isolated and cultured human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in vitro by density gradient centrifugation method, and the cells could be induced to differentiate into adipocytes. Flow cytometry results showed that umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were positive for CD90, CD73 and CD105 protein, but they were negative for CD14, CD34, CD45, CD19, HLA-DR, Stro-1 and CD106 protein. Real-time PCR detection showed that the NEP1-40 mRNA expression level was positively correlated with multiplicity of infection. Higher multiplicity of infection yielded higher NEP1-40 expression. In addition, NEP1-40 protein expression could be seen in human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells after transfected with NEP1-40. These findings suggest that the transfection of NEP1-40 gene has little impact on biological function of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, umbilical cord blood-derived stem cells, cord blood, mesenchymal stem cells, lentiviral vectors, transfection, NEP1-40, 863 program, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

黄爱华，周逸丹，张萍萍，王赛英，林媛媛，葛婷爱，陈赞. 慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 31-37.

Huang Ai-hua, Zhou Yi-dan, Zhang Ping-ping, Wang Sai-ying, Lin Yuan-yuan, Ge Ting-ai, Chen Zan. Expression of lentiviral vectors mediated NEP1-40 in mesenchymal stem cells fromhuman umbilical cord blood[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 31-37.

图/表（结果） 7

2.1 UCB-MSCs的体外分离、培养和形态学观察脐血用等量的PBS稀释后，经Ficoll-Hypaque分离液通过密度梯度离心分离，得到的单核细胞，以2×10⁶/cm²接种，72 h后可见有贴壁的细胞。此时去除培养基，用PBS洗涤一次，加入新鲜培养基，光镜下观察可见贴壁的细胞主要有两类，见图1a，一类是破骨样细胞，胞体较大，形态多样，多呈圆形或椭圆形，有多个核。另一类是间充质样细胞，胞体呈长梭形，单个核，最初多为散在存在。细胞经原代培养14 d左右，两类细胞都不断增多，见图1b、c，当细胞生长达到80%-90%融合时，用0.25%胰酶消化2 min，此时部分细胞消化下来，但光镜下观察时发现仍有较多的细胞贴壁，此类贴壁细胞需要更多消化时间才能被完全消化下来。将不同消化时间的细胞分别接种于两个培养皿中，可见2 min左右消化的细胞以长梭形为主，其内混杂有少量的圆形细胞，见图1d，e。而经过5 min左右消化的细胞则以圆形或椭圆形为主，且胞体较大，有多个核，见图1f。

Figure 1 Morphology of mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood

图1 人脐血间充质干细胞体外培养形态观察

2.2 UCB-MSCs表面标志的检测流式细胞仪检测结果显示，培养的UCB-MSCs中CD90、CD73和CD105阳性，而不表达CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1和CD106，见图2。

Figure 2 Immunophenotype of mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood detected by flow cytometry

图2 流式细胞仪检测人脐血间充质干细胞表面标记

2.3 诱导UCB-MSCs向脂肪细胞分化将间充质干细胞培养体系转换成脂肪细胞诱导体系后，可见UCB-MSCs逐渐向脂肪细胞分化，胞浆内出现脂肪滴，经油红O染色后脂肪滴呈红色，苏木精复染可见蓝色的细胞核，而没有经过诱导的细胞则无此变化。见图3。

Figure 3 Adipogenic differentiation of mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood

图3 人脐血间充质干细胞向脂肪细胞的分化

2.5 含有NEP1-40基因的慢病毒转染UCB-MSCs 结果表明，慢病毒载体可以成功转染UCB-MSCs，使其表达绿色荧光蛋白和NEP1-40，转染绿色荧光蛋白的UCB-MSCs转染效率可达90%以上，见图4。

Figure 4 Mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood were successfully transfected by lentiviral vectors and expressed green fluorescence protein (×200)

图4 慢病毒载体可以成功转染人脐血间充质干细胞，使其表达绿色荧光蛋白(×200)

2.6 NEP1-40基因转染后对UCB-MSCs生物学功能的影响见图5。转染前后相同代数的UCB-MSCs，流式细胞仪检测，结果显示细胞表面标记变化无显著差异；镜下可见NEP1-40基因转染前后细胞均为长梭形，没有发生明显变化(图5)；转染前后的细胞在增殖和分化能力方面也没有明显异常，因此认为NEP1-40基因转染后对靶细胞原有的生物学功能无明显影响。

Figure 5 Morphology of mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood before and after NEP1-40 gene transfection (×100)

图5 NEP1-40基因转染前后人脐血间充质干细胞形态变化(×100)

2.7 转染后UCB-MSCs中NEP1-40 mRNA的表达通过内参GAPDH的标准化，在不同转染拷贝数的条件下，UCB-MSCs中NEP1-40 mRNA表达量与转染拷贝数相关，转染拷贝数越高，mRNA表达水平越高。其中，MOI=0，0.5，1，2，5，10组，NEP1-40 mRNA的表达水平为0，0.210±0.038，0.495±0.103，1.316±　0.276，2.690±0.698，8.593±1.486；见图6。ANOVA分析后显示，各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。

Figure 6 Expression of NEP1-40 mRNA in mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood under different multiplicities of infection

图6 不同转染拷贝数下，人脐血间充质干细胞中NEP1-40 mRNA的表达

2.8 转染后UCB-MSCs中NEP1-40蛋白检测结果结果显示MOI=5组NEP1-40蛋白表达阳性，而MOI=0组无NEP1-40蛋白表达，见图7。

Figure 7 Detection of NEP1-40 in mensenchymal stem cells from human umbilical cord blood after transfection

图7 转染后脐血间充质干细胞的NEP1-40蛋白检测

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：实验于2008年3月至2010年8月在宣武医院完成。

材料：间充质干细胞取自正常足月产新生儿脐血(首都医科大学宣武医院产科提供，经伦理委员会批准，新生儿父母知情同意)，经体外扩增培养后用于实验。293T细胞由北京大学生命科学院惠赠。

实验方法：

UCB-MSCs的体外分离﹑培养和形态学观察：无菌条件下采集足月新生儿脐血，肝素抗凝 (20 U/mL)，用PBS以1∶1的比例混匀。将稀释后的脐血以2∶1比例缓慢叠加于Ficoll-Hypaque分离液上，435×g离心30 min，用巴士德管小心吸取中间界面的白膜层，PBS洗涤2次，用UCB-MSCs基础培养基(体积分数为10%胎牛血清+DMEM-LG)重悬制成单细胞悬液，锥虫蓝计数活细胞后以2×10⁶/cm²接种于T25培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度的孵箱中。72 h后更换培养基，弃去未贴壁细胞。以后隔天半量换液，21-28 d细胞达到80%-90%融合，用0.25%胰酶消化后传代(细胞接种浓度5×10³/cm²)。

UCB-MSCs表面标志的检测：P7代细胞长到90%融合时，去除培养基，PBS洗涤后，0.25%胰酶37 ℃消化 2 min，用PBS洗涤制成浓度为1×10⁶ L^-¹细胞悬液，荧光标记的小鼠抗人抗体CD73-PE、CD105-FITC、CD90-FITC、CD14- Percp、CD19-FITC、CD34-APC、CD45-Percp和HLA-DR-FITC，通过流式细胞仪检测细胞表面标志，同时取一管细胞做阴性对照。

诱导hUCB-MSCs向脂肪细胞分化：P6代的细胞以5×10³/cm²接种于6孔板中，培养3 d，当细胞达到60%-70%融合时，弃去培养基，加入脂肪诱导培养基，以后隔天半量换液，诱导分化16-20 d，去除分化培养基，PBS洗涤2次，经40 g/L多聚甲醛固定15 min，油红O染色15 min，PBS洗涤后，加入苏木精复染10 min。间充质干细胞的脂肪诱导分化培养基成分包括体积分数为10%胎牛血清、88%低糖DMEM、1%青链霉素、1% L-glutimax、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L人胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛。

含NEP1-40基因的慢病毒载体构建和病毒上清的包装：含NEP1-40基因的慢病毒载体构建和病毒上清的包装参照以前的方法^[8]。设计了包含酶切位点的NEP1-40扩增引物，同时在酶切位点前后加上了保护碱基、起始密码子和终止密码子。提取幼年大鼠脊髓组织总RNA，通过RT-PCR技术将RNA反转录成cDNA。以反转录产物为模板扩增出包含有NEP1-40基因序列的目的基因全长。将所得的PCR产物和慢病毒载体的转移质粒DUET101同时进行双酶切，PCR酶切产物回收备用，质粒酶切后用琼脂糖凝胶分离切开的小片段，通过凝胶回收法回收大片段载体。用T₄•DNA连接酶连接NEP1-40•PCR产物和回收的大片段载体，连接产物转化感受肽细菌HB101。铺板挑菌培养后进行菌液PCR鉴定，选取阳性克隆，提取质粒进行酶切及测序鉴定。

慢病毒颗粒的包装采用脂质体介导的瞬时转染法进行，转染前1 d将T293细胞传代于经过多聚赖氨酸包被的100 mm培养皿中，细胞总数是5×10⁶，待细胞达到70%-80%融合后进行病毒上清的包装。分别将构建好的编码NEP1-40和GFP的转移质粒，编码慢病毒载体gag，pol结构的质粒CMV△8.91，以及编码VSV-G结构的质粒PMD-G，按比例共溶于装有400 μL OPTI-MEM的聚苯乙烯管中，同时在另一装有400 μL OPTI-MEM的聚苯乙烯管中加入lipofectmaine2000，室温放置5 min后，将两个管中的液体混合，室温放置20 min。将DNA与脂质体的混合液加入到含有7.2 mL新鲜OPTI-MEM培养基的T293细胞培养皿中，混匀，37 ℃，体积分数为5%CO₂培养 12 h后弃去转染液，换用病毒收集培养基，分别于24 h和48 h后收集病毒上清，0.45 μm滤器过滤后用Ultra-Plus20浓缩病毒上清，将浓缩后的病毒上清转染293T细胞，计数GFP阳性细胞百分比，进行滴度鉴定，T=4×10⁷ TU/mL (TU，Transduction Unit)。-80 ℃保存。

含有NEP1-40基因的慢病毒转染UCB-MSCs：细胞传代后以6×10³/cm²接种于6孔板中，培养72 h后，分别以转染拷贝数为0，0.5，1，2，5，10加入浓缩后的NEP1-40和GFP病毒上清，同时以2.0 mg/L的浓度加入聚凝胺(polybrene)共培养16 h后更换新鲜培养基。转染后48 h于荧光显微镜下观察不同转染拷贝数的GFP阳性细胞百分比，分析转染效率。对于转染含有NEP1-40基因的细胞，于转染后72 h加入100 mg/L潮霉素进行筛选，筛选后48-72 h，未能成功转染的UCG-MSCs会死亡。以转染GFP的UCB-MSCs为对照，分析筛选效率，转染成功的细胞扩增后用于比较转染前后细胞形态学变化、NEP1-40 mRNA表达水平，并检测NEP1-40的蛋白分泌。

NEP1-40基因转染后对UCB-MSCs生物学功能的评价：分别取转染前后相同代数的UCB-MSCs，流式细胞仪检测细胞表面抗原，观察细胞形态学、增殖分化能力的差异，分析NEP1-40基因转染后对靶细胞生物学功能的影响。

转染后UCB-MSCs中NEP1-40 mRNA表达水平的检测：转染不同拷贝数NEP1-40慢病毒的UCB-MSCs经潮酶素筛选后扩增，收集适量的细胞(>10⁵)，液氮速冻后用TRIzol法提取RNA，分别取2 μg用oligdT 15 primer反转获得cDNA。取一管cDNA经1/3连续等比稀释后做标准曲线，同时将样品以10倍稀释后备用。以GAPDH为内参，用Real-time PCR方法比较不同拷贝数转染组间NEP1-40 mRNA的表达水平。

转染后UCB-MSCs中NEP1-40蛋白的检测：转染NEP1-40的UCB-MSCs经100 mg/L潮霉素筛选72 h后，取MOI=5组和MOI=0组细胞进行蛋白提取并用BCA试剂盒进行蛋白检测。根据目的蛋白的相对分子质量，配制10%分离胶凝胶和5%的浓缩胶。待检测蛋白样品上样量为20 μg。电泳条件：浓缩胶恒压80 V，约20 min；分离胶恒压100 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。采用半干法恒流转膜1 h，转膜后用丽春红染色试剂对膜染色，观察转膜效果。在室温中用5%脱脂奶粉(TBST溶解的，pH7.5)轻摇1 h进行封闭。随后用Western blot封闭液Ⅱ稀释一抗1∶3 000，室温孵育1 h，洗膜7次后，再用Western blot封闭液Ⅱ稀释二抗，羊抗兔-HRP 1∶10 000，室温轻摇40 min，在经过7次洗膜后进行ECL反应、胶片曝光。

主要观察指标：基因转染对细胞生物学功能的影响，实时定量PCR技术分别测定不同转染组细胞内NEP1-40 mRNA表达水平，Western blot检测转染后细胞中NEP1-40蛋白的表达。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，实验数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来研究证明间充质干细胞能高效转染表达外源性目的基因，在基因治疗领域具有广阔的应用前景^[9-10]。骨髓间充质干细胞是目前研究较为广泛的，研究证实其可为脑组织的修复和重建提供细胞来源^[11-12]。但骨髓源性间充质干细胞作为种子细胞有病毒污染可能，且其细胞数量和增殖、分化能力随着年龄增长出现明显下降趋势^[13-14]。脐血是间充质干细胞的来源之一，相对骨髓而言，具有来源广阔、取材无创、不会有肿瘤细胞及免疫原性弱等优势^[15]。如果能从脐血中分离培养得到间充质干细胞，那将是一种方便快捷的方式。

目前对于脐血中是否存在间充质干细胞，甚至作为间充质干细胞的供源一直有争议^[16-17]。实验利用密度梯度离心法从脐血中提取贴壁细胞在体外进行扩增培养，通过控制消化时间和不断传代得到形态较为一致的长梭形细胞，利用流式细胞仪检测其表面标志，证实了此类细胞表达和间充质干细胞一致的抗原表型CD73、CD90和CD105^[18-19]，成功的诱导其向脂肪方向的分化。在原代培养中另一类圆形或椭圆形的贴壁细胞，目前有研究认为类似多核破骨样细胞^[20]，可被酸性磷酸酶染色。因此认为实验从脐血中成功提取了间充质干细胞。

实验成功构建了同时表达NEP1-40和潮霉素抗性基因的多基因表达载体。在体外用携带NEP1-40和GFP基因的慢病毒载体成功转染UCB-MSCs，转染成功的UCB-MSCs同时表达潮霉素抗性基因，经过体外潮霉素筛选，未能成功转染的UCB-MSCs死亡，从而可以得到均一表达NEP1-40和绿色荧光蛋白的UCB-MSCs。实验从细胞表面标记、形态学和增殖分化能力等方面对基因转染前后的UCB-MSCs生物学功能进行比较，发现NEP1-40基因转染对UCB-MSCs原有的生物学功能没有明显影响。为了进一步证实该结果，实验对转染不同拷贝数NEP1-40的UCB-MSCs中mRNA表达水平进行检测，UCB-MSCs中无NEP1-40 mRNA表达，且转染后UCB-MSCs中NEP1-40 mRNA的表达水平与转染拷贝数相关，转染拷贝数越高，NEP1-40 mRNA的表达水平越高。此外，通过对MOI=5组和MOI=0组细胞进行蛋白检测，证实了UCB-MSCs中无NEP1-40蛋白分泌，转染了NEP1-40的UCB-MSCs可分泌NEP1-40蛋白。依据实验结果，在以后的实验中有希望通过转染含有NEP1-40基因的慢病毒使UCB-MSCs分泌NEP1-40蛋白，同时可通过控制慢病毒载体转染的拷贝数来控制UCB-MSCs中NEP1-40 mRNA表达水平，通过本实验可得到高纯度可溶性NEP1-40蛋白，并作为Nogo-66的竞争性抑制剂，直接封闭受体蛋白NgR，阻断Nogo-66与NgR结合后介导的轴突生长锥溃变作用，促进受损的轴突生长及功能恢复，进而降低中枢神经系统损伤诱发的抑制性蛋白的负面作用，促进神经功能恢复。

实验证实，利用密度梯度离心法在体外成功的从脐血中提取间充质干细胞，通过慢病毒载体介导的基因修饰方式使脐血间充质干细胞表达NEP1-40，通过药物筛选方式获得均一表达NEP1-40的UCB-MSCs，使其分泌NEP1-40蛋白，并可能通过控制转染拷贝数在一定水平上调整NEP1-40 mRNA表达水平。从而将细胞治疗与基因治疗有机地结合，为神经系统疾病治疗提出了新的思路。实验中也发现了需要进一步解决的问题，例如如何提高从脐血中提取间充质干细胞的成功率，以及获得纯度更高的间充质干细胞。高拷贝数的转染是否会对UCB-MSCs的生物学特性有所影响以及转染后的细胞上清液中是否也存在一定浓度的NEP1-40等。

慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达

Expression of lentiviral vectors mediated NEP1-40 in mesenchymal stem cells fromhuman umbilical cord blood

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